Pernah menginginkan anak dengan tubuh tinggi besar dan atletis? Atau berambut ikal, bermata biru, berkulit eksotis dengan hidung mancung? Zaman di mana adegan-adegan seperti dalam film fiksi ilmiah dimana kita dapat merekayasa manusia ibarat Frankenstein di tingkat molekuler namun sesuai keinginan, selera dan imajinasi kita, mungkin sudah tiba.
APA ITU CRISPR?
Secara sederhana, CRISPR adalah suatu teknik rekayasa genetika melalui perubahan genom dengan kompleks protein Cas9 yang dipandu RNA pemandu (guide RNA) untuk merubah sekuensi DNA tertentu yang terpilih, dan memodifikasi fungsi gen tersebut sesuai dengan tujuan yang kita inginkan. Kepanjangan CRISPR adalah Clusters of Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. CRISPR (dibaca krisper) juga dikenal sebagai “CRISPR-Cas9”, karena CRISPR merupakan renggangan khusus dari DNA, dan protein terpenting dalam proses ini adalah Cas9 yaitu suatu enzim yang bertindak bagaikan gunting molekuler yang mampu memotong untaian tertentu dari DNA.
Metode CRISPR pada mulanya diketahui karena sebuah mekanisme yang berasal dari bakteri archaea, mikroorganisme ini menggunakan RNA yang dihasilkan CRISPR dan berbagai protein Cas, termasuk Cas9 untuk menangkal serangan virus dan benda asing lainnya. Bakteri ini melakukannya dengan cara memotong dan menghancurkan DNA dari para penyerang tersebut. Jika seluruh komponen dan bahan yang digunakan tersebut diimplementasikan pada organisme yang lebih rumit maka metode ini dapat diimplementasikan sebagai sarana untuk memanipulasi atau mengedit gen.
Pada tahun 2017, Hiroshi Nishimasu dari Universitas Tokyo dan Mikihiro Shibata dari Universitas Kanazawa pertama kali menunjukkan dengan tampilan visual bagaimana saat CRISPR beraksi, dengan mikroskop berkekuatan atom.
Single-molecule movie of DNA search and cleavage by CRISPR-Cas9. pic.twitter.com/3NQxmbvzJF— hnisimasu (@hnisimasu) November 10, 2017
MANFAAT CRISPR
Kegunaan dan keterbatasan
Metode CRISPR-Cas9 menjadi terkenal dalam beberapa tahun belakangan ini. George Church, seorang dosen bidang genetika di fakultas kedokteran Harvard, mengungkapkan teknologi ini mudah digunakan dan sekitar 4 kali lebih efisien bila dibandingkan dengan alat untuk mengedit genom sebelumnya, yaitu TALENS (Transcription Activator-Like Effector NucleaseS). Pada tahun 2013, laporan pertama yang menggunakan CRISPR-Cas9 untuk mengedit sel manusia pada penelitian diterbitkan oleh peneliti Church dan Feng Zhang dari the Broad Institute of the Massachusetts Institute of Technology and Harvard.
Penelitian in vitro maupun pada model binatang dengan penyakit manusia menunjukkan bahwa teknologi ini efektif dalam mengkoreksi defek genetik. Contoh dari beberapa penyakit diantaranya adalah fibrosis sistik (cystic fibrosis), familial hipertiroidisme, katarak genetika, leukemia limfoblastik herediter dan anemia Fanconi, berdasarkan artikel ulasan yang diterbitkan pada tahun 2016 oleh the journal Nature Biotechnology . Penelitian-penelitian ini membuka jalan untuk aplikasi-aplikasi terapeutik lainnya pada manusia.
Neville Sanjaya, dari Pusat Penelitian Genom New York dan juga seorang asisten dosen bidang biologi, neurosains dan fisiologi dari New York University mengungkapkan bahwa persepsi publik akan CRISPR difokuskan pada pemikiran bahwa pengeditan gen secara klinis adalah untuk menyembuhkan penyakit, ini merupakan kemungkinan yang menggembirakan namun hanya salah satu bagian kecil dari kemungkinan manfaat dan potensi yang lain.
Penerapan CRISPR pada embrio manusia
Ilmuwan yang berasal dari Cina telah pertama kali melakukan pengeditan pada embrio manusia, yang menimbulkan berbagai perdebatan dan kontroversi.
Peneliti dari universitas Sun Yat-sen, Cina, menggunakan teknik CRISPR untuk memodifikasi gen pada embrio manusia yang menyebabkan suatu kelainan darah yang mematikan yaitu Beta Thalassemia. Prosedur ini, yang dilakukan pada embrio manusia yang nonviable, tidak sepenuhnya sukses, seperti dilaporkan oleh Nature News.
Penelitian ini dipublikasikan secara online pada tanggal 18 April 2015 pada the journal Protein & Cell, dan telah menyebabkan munculnya berbagai pertanyaan di kalangan komunitas ilmuwan terlebih mengenai risiko dari prosedur tersebut dan sisi etika akan penggunaannya pada embrio manusia.
George Daley, seorang ilmuwan Biologi bidang stem-cell dari fakultas kedokteran Universitas Harvard, mengatakan kepada Nature News bahwa penelitian embrio ini merupakan peringatan keras kepada para praktisi bahwa teknologi ini masih belum siap untuk digunakan dalam rangka memberantas penyakit.
Sejak 2013, para ilmuwan telah menggunakan metode ini untuk mengedit gen dalam sel dari berbagai spesies, termasuk sel manusia dewasa dan embrio hewan, namun penelitian di cina ini merupakan yang pertama kalinya dilakukan untuk memodifikasi embrio manusia.
Pada penelitian ini, Junjiu Huang, seorang peneliti genetika di universitas Sun Yat-sen, menginjeksi kompleks CRISPR/Cas9 ke dalam embrio manusia untuk memperbaiki gen yang bertanggungjawab terhadap Beta thalassaemia, sebuah kelainan darah yang fatal yang menyebabkan penurunan produksi haemoglobin. Embrio-embrio ini, yang diperoleh dari klinik-klinik fertilitas setempat, tidak dapat menjadi janin hidup karena telah difertilisasi oleh dua sperma, yang mencegahnya berkembang sebagaimana mestinya.
Para peneliti ini melakukan prosedur terhadap 86 embrio, dan memerlukan waktu 4 hari untuk melakukan keseluruhan proses pengeditan gen. 71 embrio bertahan, dan peneliti melakukan pengujian genetis dengan 54 diantaranya.
Hanya 28 embrio yang termodifikasi secara sukses, yang diartikan gen yang rusak dapat dibuang dan hanya beberapa diantara itu yang dapat digantikan oleh gen yang sehat sebagai penggantinya. Angka kesuksesan perlu mendekati seratus persen, jika teknik ini hendak digunakan pada embrio manusia yang viable, demikian diungkapkan oleh para peneliti.
Prosedur ini juga mengakibatkan mutasi-mutasi yang mengkhawatirkan pada bagian lain dari genom dan dengan kejadian lebih banyak bila dibandingkan dengan embrio tikus atau sel manusia dewasa yang menjalani prosedur yang sama. Mutasi ini dapat memberikan efek yang merugikan terhadap sel, yang menjadi salah satu kekhawatiran yang besar dalam bidang pengeditan gen. Dikarenakan permasalahan keamanan ini, penggunaan metode ini pada manusia terutama embrio yang tidak dapat memberikan persetujuan, memunculkan pertanyaan serius mengenai etika, ungkap para ilmuwan. Para editor dari the journal Nature and Science menolak menerbitkan penelitian ini dikarenakan alasan etika ini, demikian dikatakan Huang dikutip oleh Nature News.
CRISPR dalam bidang makanan dan pertanian
Teknologi CRISPR telah digunakan dalam industri makanan dan agrikultur untuk merancang kultur probiotik dan memvaksinasi kultur-kultur industri, misalnya untuk yogurt, untuk melawan virus. Ia juga digunakan dalam bidang pertanian untuk memperbaiki masa panen, ketahanan terhadap kemarau maupun kandungan nutrisi.
CRISPR untuk hewan
Satu lagi potensi aplikasi metode ini adalah untuk menciptakan gene drives. Gene drives adalah suatu sistem genetika untuk menciptakan kondisi yang meningkatkan peluang menurunnya ciri khas tertentu dari orang tua ke keturunannya. Pada akhirnya, setelah beberapa generasi tertentu, ciri khas tersebut akan menyebar ke keseluruhan populasi, demikian menurut Wyss Institute. Gene drives dapat membantu dalam mengendalikan penyebaran penyakit seperti malaria dengan cara meningkatkan sterilitas (kemandulan) pada vector penyakit, nyamuk Anopheles gambiae betina, menurut artikel Nature Biotechnology tahun 2016. Sebagai tambahan, gene drives dapat juga digunakan untuk memberantas spesies invasif dan membalikkan resistensi pada pestisida dan herbisida, menurut sebuah artikel oleh Kenneth Oye et al. yang diterbitkan the journal Science pada tahun 2014.
CARA KERJA CRISPR
Metode ini dilakukan di daerah khusus DNA yang terdiri dari dua karakteristik khas : pengulangan nukleotida dan adanya spacer. Sekuensi nukleotida yang mengulang, bahan bangunan dari DNA, tersebar di seluruh wilayah CRISPR. Sedangkan spacer adalah bagian kecil DNA yang menyelang-nyelingi (disela-sela) sekuensi yang mengulang tersebut.
Pada kasus bakteri, spacer-spacer diambil dari virus yang telah menyerang suatu organisme sebelumnya. Mereka berperan sebagai bank memori, yang yang dapat mengakibatkan bakteri mampu mengenali virus tersebut dan melawan dalam serangan yang akan dating. Pada bakteri, kompleks ini menyediakan pertahanan terhadap DNA asing, seperti plasmid (bagian kecil DNA yang berbentuk lingkaran) dan phages (virus yang menginfeksi bakteri).
Teknik ini melibatkan kompleks enzim yang dikenal sebagai CRISPR/Cas9, yang banyak ditemukan di berbagai bakteri. CRISPR merupakan sekuensi singkat RNA yang berulang, yang cocok dengan sekuensi genetika yang hendak dimodifikasi peneliti yang bersangkutan. Ia bekerja beriringan dengan Cas9, suatu enzim yang berfungsi untuk memotong DNA, seperti sepasang gunting molekuler.
Pertama, kompleks CRISPR/Cas9 mencari keseluruhan DNA sel sampai ia menemukan dan mengikat sekuensi yang cocok dengan CRISPR tersebut, seperti dikatakan oleh John Reidhaar-Olson, seorang ahli biokimia dari fakultas kedokteran Albert Einstein College New York, yang tidak terlibat dalam penelitian ini. Kemudian Cas9 akan memotong DNA, dan terakhir sel akan memperbaiki potongan tersebut, dalam kasus ini dengan cara memasukkan bagian DNA yang telah disediakan oleh peneliti, demikian diterangkan Reidhaar-Olson kepada Live Science.
Proses ini pertama kali didemonstasikan secara eksperimental oleh Rodolphe Barrangou dan sejumlah tim peneliti di Danisco, sebuah perusahaan kandungan makanan. Pada sebuah paper di tahun 2007 yang dipublikasikan dalam the Journal Science. Para peneliti menggunakan bakteri Streptococcus thermophilus, yang umum ditemukan pada yogurt dan kultur produk susu, sebagai model. (bakteri lain yang kini digunakan antara lain adalah Staphylococcus aureus dan Streptococcus pyogenes) Mereka mengobservasi bahwa setelah serangan virus, spacer baru tergabungkan ke dalam wilayah CRISPR. Terlebih lagi, sekuensi DNA dari spacer ini sama persis dengan bagian dari genom virus. Mereka juga memanipulasi spacer dengan cara mengambil atau memasukkannya ke dalam sekuensi DNA yang baru. Dengan cara ini, mereka mampu merubah resistensi bakteri terhadap serangan oleh virus yang spesifik. Sehingga para peniliti ini mengkonfirmasikan bahwa CRISPR memainkan peranan dalam meregulasi imunitas bakteri.
CRISPR RNA (crRNA):
Begitu spacer dimasukkan dan virus menyerang kembali, sebagian dari CRISPR ditranskribsi dan diproses ke dalam CRISPR RNA atau "crRNA". Sekuensi nukleotida dari CRISPR berperan sebagai template untuk menghasilkan sekuensi komplementer berupa RNA untai tunggal. Setiap crRNA terdiri dari pengulangan nukleotida dan porsi spacer, menurut satu ulasan tahun 2014 yang dilakukan oleh Jennifer Doudna dan Emmanuelle Charpentier, yang dipublikasikan pada the journal Science.
Cas9:
Protein Cas9 adalah enzim yang memotong DNA asing. Protein ini umumnya menempel kepada dua jenis molekul RNA : crRNA dan tracrRNA ("trans-activating crRNA"). Kedua molekul ini kemudian menuntun Cas9 ke situs target dimana ia akan memotong. Bentangan DNA ini komplementer terhadap renggangan 20 nukleotida dari crRNA. Menggunakan dua wilayah yang terpisah, atau "domains" pada strukturnya, Cas9 memotong kedua untai dari double helix DNA, membuat pataahan yang dikenal sebagai "double-stranded break", menurut artikel 2014 tersebut.
Terdapat suatu mekanisme keamanan yang tertanam, yang menjamin bahwa Cas9 tidak memotong sembarangan atau salah. Sekuensi DNA pendek yang dikenal sebagai PAMs ("protospacer adjacent motifs") berperan sebagai penanda dan terletak tepat disebelah sekuensi DNA target. Jika kompleks Cas9 tidak menemukan PAM disebelah sekuensi DNA target, makai a tidak akan memotong. Ini merupakan salah satu kemungkinan mengapa Cas9 tidak menyerang area CRISPR pada bakteri, menurut ulasan tahun 2014 yang diterbitkan pada Nature Biotechnology.
CRISPR-Cas9 sebagai alat untuk mengedit genom
Genom dari berbagai organisme mengkode serangkaian pesan dan instruksi di dalam sekuensi DNA mereka masing-masing. Mengedit genom melibatkan perubahan pada sekuensi-sekuensi tersebut, sehingga akan merubah pesan dan instruksi yang berkaitan. Hal ini dapat tercapai dengan cara memasukkan suatu potongan atau patahan dalam DNA dan memperdayai mekanisme alamiah perbaikan DNA sel untuk mengenalkannya pada perubahan yang dikehendaki. CRISPR-Cas9 dapat menjadi sarana untuk melakukan hal tersebut.
Pada tahun 2012, dua penelitian penting dipublikasikan pada jurnal Science dan PNAS, yang membantu mentransformasikan CRISPR-Cas9 bakterial menjadi suatu alat pengeditan genom yang sederhana dan dapat diprogram.
Penelitian-penelitian ini, yang dilakukan oleh dua tim terpisah, menyimpulkan bahwa Cas9 dapat diarahkan untuk memotong wilayah manapun dari DNA. Hal ini dapat dilakukan. Hal ini dapat dilakukan dengan secara sederhana mengubah sekuensi nukleotida crRNA, yang terikat ke target DNA komplementer. Pada artikel ilmiah tahun 2012 ini, Martin Jinek et al selanjutnya lebih menyederhanakan system tersebut dengan menggabungkan crRNA dan tracrRNA untuk menciptakan suatu "guide RNA" tunggal atau RNA pemandu. Sehingga, pengeditan genom dengan Teknik ini danya membutuhkan dua komponen: guide RNA dan protein Cas9.
Dalam prakteknya, anda mendesain suatu renggangan yang terdiri dari 20 pasangan nukleotida basa yang cocok dengan gen yang hendak anda edit, demikian dijelaskan oleh George Church, seorang dosen genetika pada fakultas kedokteran Harvard. Sebuah molekul RNA yang komplementer terhadap 20 pasangan basa itu kemudian dirancang. Church menekankan bahwa sekuensi nukleotida itu hanya terdapat pada gen target dan tidak terdapat di tempat lainnya manapun pada genom. Kemudian RNA dengan protein Cas9 akan memotong, seperti sepasang gunting, DNA pada letak itu, dan secara ideal tidak di tempat lainnya, ungkap Church.
Begitu DNA terpotong, mekanisme alamiah perbaikan sel mulai bekerja untuk memperkenalkan mutase atau perubahan lainnya terhadap genom. Terdapat dua cara agar hal ini dapat terjadi. Menurut proyek Huntington’s Outreach dari Universitas Stanford, metode pertama melibatkan melekatkan kembali kedua potongan. Metode ini dinamakan penggabungan ujung non-homolog atau "non-homologous end joining," yang cenderung berujung timbulnya error, nukleotida secara tidak sengaja dapat masuk atau terhapuskan, yang akan mengacaukan gen. Metode yang kedua, patahan diperbaiki dengan mengisi celah dengan suatu sekuensi nukleotida, agar hal tersebut dapat terjadi, sel menggunakan suatu untai pendek DNA sebagai template. Ilmuwan dapat menyediakan template DNA sesuai keinginan dan kehendak mereka, sehingga dapat menulis gen sesuai rencana, atau mengkoreksi suatu mutasi.
ETISKAH INI?
Berbagai potensi penerapan dari teknologi CRISPR di sisi lain memunculkan berbagai pertanyaan mengenai sisi etika dan konsekuensi dari ikut campurnya kita terhadap genom.
Pada suatu artikel ilmiah di tahun 2014, Oye et al menunjukkan suatu potensi adanya dampak ekologis dari penggunaan gene drive. Suatu ciri khas yang diperkenalkan oleh metode ini dapat menyebar melebihi populasi target kepada organisme lain melalui perkawinan silang. Gene drives juga dapat mengurangi diversitas genetika / keanekaragaman flora dan fauna dari populasi target.
Membuat modifikasi genetik terhadap embrio dan sel reproduksi seperti sperma dan sel telur dikenal sebagai pengeditan germline. Dikarenakan perubahan terhadap sel-sel ini dapat diturunkan terhadap generasi-generasi selanjutnya, penggunaan teknologi CRISPR telah memunculkan sejumlah kekhawatiran etis. Di dunia kedokteran, segala tindakan yang dilakukan terhadap pasien haruslah terlebih dahulu mendapatkan persetujuan dari pasien yang bersangkutan atau pihak keluarga terdekat atau dikenal sebagai informed consent, apabila efek dari suatu tindakan mencapai banyak generasi setelahnya dikhawatirkan generasi tersebut tidak menyetujui akan tindakan ini, terlebih jika nanti kelak terdapat efek merugikan yang terkait.
Efikasi yang beragam, efek off-target dan pengeditan yang tidak tepat semua berpeluang menimbulkan risiko keamanan. Pada suatu artikel di tahun 2015, David Baltimore beserta sekelompok ilmuwan, ahli etika dan ahli hokum mencatat bahwa pengeditan germline meningkatkan kemungkinan dari adanya konsekuensi yang tidak diinginkan pada generasi selanjutnya. “dikarenakan terdapat keterbatasan pengetahuan kita terhadap genetika manusia, interaksi antar gen dengan lingkungan, dan jalur/pathway penyakit (termasuk diantaranya interaksi antara satu penyakit dengan penyakit lainnya didalam tubuh pasien yang sama)” demikian salah satu kutipan dari artikel tersebut.
Kekhawatiran etika lainnya adalah jika germline editing akan beralih fungsi dari sebagai alat menyembuhkan atau menghilangkan penyakit ke sarana untuk meningkatkan fitur dan karakteristik tubuh manusia, maka bukan tidak mungkin negara-negara, perusahaan-perusahaan, atau keluarga-keluarga kaya akan berlomba-lomba untuk menciptakan manusia-manusa terkuat, tertinggi, terbesar, tercepat, tercantik, tertampan dan lain sebagainya.
Untuk mengantisipasi kekhawatiran ini, the National Academies of Sciences, Engineering and Medicine bersama menyusun suatu laporan komprehensif beserta panduan dan rekomendasi terhadap pengeditan genom.
Walaupun the National Academies menghimbau kewaspadaan dalam penerapan pengeditan germline, mereka menekankan bahwa “kewaspadaan bukan berarti pelarangan”. Mereka menyarankan bahwa germline editing dilakukan hanya terhadap gen yang mengarah kepada penyakit serius dan hanya dilakukan jika tidak terdapat terapi alternatif lainnya yang lebih memadai. Tambahan kriteria lainnya, mereka menekankan kebutuhan adanya data mengenai manfaat dan resiko kesehatan dan perlunya pengawasan berkesinambungan selama uji coba klinis. Mereka juga menyarankan menindaklanjuti (follow up) keluarga terhadap generasi-generasi mereka seterusnya.
KENDALA TERKINI
Walaupun CRISPR-Cas9 termasuk salah satu metode termudah bila dibandingkan metode pengeditan genom lainnya, bukan berarti tidak ada rintangan.
“Saya pikir keterbatasan dari CRISPR adalah bahwa ia tidak seratus persen efisien" demikian diungkap George Church kepada Live Science. Terlebih lagi, efisiensi pengeditan genom dapat bervariasi. Menurut sebuah artikel ilmiah oleh Doudna dan Charpentier, dalam penelitian yang dilakukan pada beras, pengeditan genom hanya berhasil pada hampir 50 persen dari sel yang menerima kompleks Cas9-RNA. Dimana, menurut analisis lain menunjukkan, tergantung dari target, efisiensi pengeditan dapat mencapai setinggi 80 persen.
Kemudian terdapat fenomena "off-target effects", dimana pemotongan DNA terjadi pada lokasi selain target yang dituju. Hal ini dapat mengakibatkan pada timbulnya mutase yang tidak diinginkan. Terlebih lagi, Church mencatat meskipun metode ini memotong pada target yang benar, tetapi ada kemungkinan tidak mendapat pengeditan yang presisi. Ia menyebut ini sebagai “vandalisme genom”.
Penelitian terbaru dari Charlesworth et al menemukan bahwa kekebalan tubuh dan antibodi T-cell dari tubuh pasien itu sendiri dapat mengganggu keberadaan protein Cas9. Tentu para peneliti harus menyiasati berbagai kendala ini, sebelum menjadi metode yang akan digunakan secara luas.
0 comments:
Posting Komentar